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柿属植物 ISSR 分析技术的建立

发表时间:2018-2-12 23:51:48 文章来源:必赢亚洲教育网

柿属植物?ISSR分析技术的建立*?

张青林 罗正荣?

**?(华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室,武汉,430070)

摘 要 以部分柿属植物(Diospyros ?spp. )为试材,对?ISSR-PCR?反应体系的?Mg?2+?

浓 度、dNTPs?浓度、引物浓度、模板?DNA?浓度、Taq?酶浓度、退火温度及扩增循环次数进行 了探讨,确立了适合柿属植物?ISSR?分析技术体系:在?25μL?反应体系中,含?1×Buffer ,?Mg?2+?2.0?或?2.5mmol/L,dNTPs?0.2mmol/L,引物?0.6μmol/L,Taq?酶?1U,甲酰胺2%,模 板?DNA?2.4ng/μL ;PCR?扩增程序:94℃变性?3min;94℃?30s ,(Tm+2)℃(根据引物不同 设定)45s ,72℃?1.5min ,35?个循环;72℃延伸?7min;2%琼脂糖电泳分离?PCR?产物。本文 结果可为柿属植物的遗传多样性和分子系统学研究提供技术支持。

关键词 柿属植物;ISSR ;技术程序?

Establishment?of?Inter-Simple?Sequence?Repeat?Technique?

in?GenusDiospyros ?spp.*?

Zhang?Qinglin,?Luo?Zhengrong**?

(KeyLaboratory?for?Horticultural?Plant?Biology,?MOE,?Huazhong?Agricultural?University,?Wuhan,?Hubei,?430070?China)?

Abstract ?A?protocol?of?reproducible?ISSR(inter-simple?sequence?repeat)?was?established?in?

Diospyros ?spp . ?The?main?factors?influencing?ISSR-?PCR?including?the?concentration?of?Mg?2+?

,?dNTPs,?primer,?template?DNA, ?Taq ?polymerase,?and?annealing?temperature,?PCR?cycles?were?investigated.?The?optimal?reaction?conditions?were?as?follow?in?25μL reaction?system:?1×buffer,?Mg?2+?2.0?or?2.5mmol/L,?dNTPs?0.2mmol/L,?primer?0.6μmol/L,?Taq?polymerase?1U,?formamide?2%,?template?DNA?2.4ng/μL.?The?optimal?amplification?program?was:?3min?initial?denaturation?step(94℃),?followed?by?35?cycles?of?30s?(94℃),?45s?[(Tm+2)?℃,?according?to?different?primer],?and?1.5min?(72℃).?The?reactions?were?completed?by?a?final?extension?step?of?7min(72℃).?The?PCR?products?were?analyzed?by?electrophoresis?using?a?2%?agarose?gel.?The?result?will?be?useful?for?the?analysis?of?the?interspecies?genetic?diversity?and?molecular?systematics?in?Diospyros?spp.?by?ISSR.. ?

Key?Words?Diospyros ?spp.??ISSR??Protocol?1994?年加拿大蒙特利尔大学?

Zietkiewicz?等?[1]?

发展的?ISSR (inter-simple?sequence?repeat )和美国杜邦公司?Wu?等?[2]?建立的称为?RAMPs (random?amplified?microsatellite?polymorphisms)的技术,是一 种基于微卫星序列的新的分子标记,其随机 分布于真核生物基因组内。ISSR?利用人工 合成的?16~18?个核苷酸重复序列(2、3、4?或?5?核苷酸重复)作为引物,在引物的?3’?端或?5’端加上?2~4?个随机选择但通常是简 并的核苷酸,对?SSR(simple?sequence?repeat)?之间的?DNA序列进行?PCR?扩增,而不是扩

增?SSR?本身。ISSR?为显性标记,呈孟德尔

方式遗传。ISSR?以其简便,不需预先知道 序列信息,重复性强等特点已开始广泛应用 于多种作物的遗传育种研究。目前,在水稻?[3]?

、柑桔?[4]?、梨?[5]?、核桃?[6]?、桃?[7]?等作物上进 行了品种鉴定、亲缘关系分析、分子遗传图 谱构建等方面的工作。

柿属植物?ISSR?反应体系的建立和运用 该技术构建种质资源的指纹图谱迄今未见 报道。由于?ISSR?是一种基于?PCR?反应的分

子标记,其反应受到各种因素(如?Mg?2+?

、引 物、dNTPs ,Taq ?DNA聚合酶等)的影响。?

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